藥物治療（化療、靶向或免疫藥物）是非常重要的癌癥治療手段。但是隨著用藥時間的推移，癌細胞幾乎會對所有藥物產(chǎn)生耐藥性，最終導致治療失敗。多藥耐藥ABC轉(zhuǎn)運蛋白介導的藥物外排是一種常見的癌細胞耐藥機制。ABC轉(zhuǎn)運蛋白具有廣泛的底物譜，能夠從細胞外排許多外源性化學物質(zhì)，包括長春花生物堿、鬼臼素、蒽環(huán)類藥物、紫杉烷類和激酶抑制劑等。因此，在一線臨床化療過程中，由于它們對藥物的外排，使得治療效果大大減弱甚至消失。

人類ABC轉(zhuǎn)運蛋白C亞家族成員ABCC3（亦稱多藥耐藥蛋白MRP3）廣泛表達于各種組織，如腎上腺、肝臟、胰腺、膽囊和小腸。其擁有廣泛的底物特異性，除了轉(zhuǎn)運外源藥物而導致耐藥性，還能夠運輸各種內(nèi)源代謝物，如葡萄糖醛酸膽紅素、膽汁酸和類固醇激素。因此，ABCC3參與體內(nèi)多種生理過程，與人類疾病密切關(guān)聯(lián)，例如膽汁酸和雌激素在細胞內(nèi)積累導致的妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積 (ICP)。

近日，中國科學技術(shù)大學生命科學與醫(yī)學部陳宇星教授和周叢照教授課題組，利用單顆粒冷凍電鏡技術(shù)解析了人類ABCC3無配基結(jié)合 (apo-form)以及生理底物—葡萄糖醛酸雌二醇 (E217βG) 和硫酸脫氫表雄酮 (DHEAS) 結(jié)合的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，整體分辨率分別為3.1、3.7和3.5??；诘鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)分析以及生化分析的結(jié)果，作者發(fā)現(xiàn)ABCC3具有一個雙親性的底物結(jié)合口袋，兩個綴合的激素分子以不對稱方式占據(jù)該底物口袋。結(jié)合以前的文獻報道，作者提出了同類多藥耐藥蛋白底物結(jié)合口袋的共同特征，為合理設(shè)計MRPs的抑制劑提供了方向。相關(guān)研究成果以 “Placing steroid hormones within the human ABCC3 transporter reveals a compatible amphiphilic substrate-binding pocket” 為題于2023年7月24日在線發(fā)表在《TheEMBO Journal》上。

結(jié)構(gòu)分析表明，apo-form ABCC3結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)向細胞質(zhì)基質(zhì)開口 (inward-facing) 的構(gòu)象：兩個核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域 (NBD) 彼此分開，兩個跨膜結(jié)構(gòu)域 (TMD) 形成一個朝向細胞質(zhì)基質(zhì)開放的“V形”底物轉(zhuǎn)運通道。與經(jīng)典的ABC轉(zhuǎn)運蛋白不同，其N端有一個額外的五股跨膜螺旋組成的TMD0結(jié)構(gòu)域。TMD0的五股跨膜螺旋聚攏在一起，形成一個緊湊而獨立的結(jié)構(gòu)域（圖1）。TMD0上的第二股跨膜螺旋（transmembrane helix, TM）TM2通過與TMD1上的TM6形成一個約1700?2的相互作用界面，從而與核心結(jié)構(gòu)域相互作用。但檢測ABCC3的ATP水解酶活以及放射性底物轉(zhuǎn)運實驗表明，TMD0結(jié)構(gòu)域?qū)BCC3的轉(zhuǎn)運功能并不是必須的，推測其可能影響ABCC3在極化細胞上的定位或者與其它蛋白有相互作用。

圖1：apo-form ABCC3結(jié)構(gòu)

結(jié)合底物E217βG的ABCC3仍然采用inward-facing構(gòu)象，底物口袋關(guān)鍵殘基的局部重排幫助E217βG分子的結(jié)合與固定。在該結(jié)構(gòu)中，兩個E217βG分子在空間中以“V型”協(xié)同結(jié)合在ABCC3內(nèi)部。其中E217βG分子的疏水甾核占據(jù)疏水口袋匯并聚成“V型”的頂點，兩個親水的葡萄糖醛酸基團分別位于TMD1和TMD2兩側(cè)的堿性殘基形成的極性口袋中（圖2）。生化實驗表明，位于TMD1一側(cè)的兩個堿性殘基Arg1193和Arg1245對于E217βG分子的結(jié)合十分關(guān)鍵，它們的突變會導致底物刺激的ATP酶活性完全消失，表明精氨酸的長側(cè)鏈以及強堿性對于底物的結(jié)合是必要的。

圖2：E217βG底物結(jié)合口袋

盡管DHEAS和E217βG具有一個類似的疏水甾核，但E217βG的葡萄糖醛酸基團位于甾核的17′號位，而DHEAS的磺酸基位于甾核的3′位。在DHEAS結(jié)合的ABCC3結(jié)構(gòu)中，有類似的“V型”結(jié)合模式（圖3），但與E217βG相比， DHEAS分子的甾核呈現(xiàn)相反方向，從而使磺酸基也能夠占據(jù)在TMD1和TMD2兩側(cè)的堿性口袋。 其磺酸基與TMD1上保守的兩個精氨酸Arg1193與Arg124形成鹽鍵，生化活性實驗表明這些極性相互作用對DHEAS的識別非常重要。

圖3：DHEAS結(jié)合位點

作者進一步分析了已報道的MRPs結(jié)構(gòu)及其底物，發(fā)現(xiàn)它們都具有一個帶負電荷的基團綴合到疏水的核心結(jié)構(gòu)。ABCC3的底物結(jié)合口袋除了擁有兩個正電的親水區(qū)域外，還有一個較大的疏水腔，因此正好契合底物的相互結(jié)合。TMD1一側(cè)存在一簇堿性殘基且在MRPs中高度保守；相比較之下位于TMD2一側(cè)的親水區(qū)域的正電性較弱且保守性較差。因此，作者根據(jù)底物的大小以及綴合方式的不同，將MRPs的底物分為三類，并提出相應的底物結(jié)合方式（圖4）?？傊?，該研究不僅闡明了ABCC3特異性識別底物的分子機制，而且還提出了所有MRPs共同的底物結(jié)合模式，進一步拓寬了我們對多藥耐藥分子機制的理解。

圖4：MRPs底物結(jié)合模式

中國科學技術(shù)大學陳宇星教授、周叢照教授和侯文韜副教授為該論文的共同通訊作者，博士生王潔為該論文的第一作者。冷凍電鏡數(shù)據(jù)收集工作在中國科學院北京生物物理研究所和中國科學技術(shù)大學集成影像中心完成。該研究得到了科技部、國家自然科學基金委、中國科學院和中國科學技術(shù)大學等機構(gòu)的資助。

原文鏈接：https://doi.org/10.15252/embj.2022113415

（生命科學與醫(yī)學部、科研部）

來源：中國科大新聞網(wǎng)